[ＲＮＡｉ抑制肝星状细胞ＴＩＭＰ－Ｉ基因表达及对细胞生物学行为的影响]哪些方法可以抑制细胞的基因表达

　　摘　要：研究了siRNA对大鼠肝星状细胞(CFSC)TIMP-I基因表达及对细胞生物学行为的影响，用RT-PCR方法获得带有T7启动子的TIMP-I全基因序列，体外转录法获得TIMP-1dsRNA，Diccr酶切后得到siRNA，用质脂体将siRNA转染至CFSC，RT-PCR检测TIMP-ImRNA的表达，MTT方法检测细胞生长，流式细胞仪检测细胞凋亡，结果成功获得TIMP-IsiRNA，将TIMP-IsiRNA转染至CP5C12、24、48h后，与对照相比，TIMP-ImRNA的表达逐渐下降，经OuanitYOnc(BIO-RAD，USA)分析后，其抑制率分别为49.18％、58.72％和64.73％；siRNA转染CFSC细胞后，CFSC生长受到抑制，细胞凋亡不明显，实验结果表明体外转录法得到的siRNA能有效地降低大鼠CFSC中TIMP-I的表达，明显抑制CFSC的增殖，但不直接引起CFSC的凋亡。

　　关键词：RNAi；基质金属蛋白酶组织抑制因子-1；肝星状细胞；细胞凋亡

　　中图分类号：R34　文献标识码：A　文章编号：1007-7847(2007)04-0342-06

　　基质金属蛋白酶组织抑制因子－1(TIMP-1)是近年发现的一种由巨噬细胞和结缔组织细胞产生，可抑制基质金属蛋白酶(MMPs)活性的糖蛋白，其分子质量为20kD，由207个氨基酸组成，TIMP-1广泛存在于组织和体液中，但在正常肝组织中却很少表达，在发生肝纤维化时，肝组织中TIMP-I基因表达水平随着肝纤维化程度的加重而增加，当肝纤维化的逆转时其表达水平下降，可见了IMP-1对肝纤维化的维持起着重要的作用，目前抑制T ……此处隐藏4932个字…… 是新的基因阻断技术，是由双链siRNA介导的、在转录后mRNA水平关闭相应基因的表达，是序列特异性的转录后基因沉默，具有高效、特异、简单等特点，目前获得siRNA的方法主要有：体外转录法、化学合成法、载体表达法等，本研究采用体外转录法获得siRNA，该方法与其他方法相比较，可大量、快速制备目的siRNA，并能省去大量的筛选工作。

　　3．3　TIMP-1与肝星状细胞增殖及凋亡的关系

　　由于活化的肝星状细胞具有增殖明显的特征，其数量的增多，也会导致ECM的增加而造成肝纤维化，因此，抑制活化的肝星状细胞的增殖，对肝纤维化的治疗也具有重要意义，本研究用TIMP-IsiRNA转染CFSC后通过MTT实验发现细胞生长受到抑制，表明沉默TIMP-1的基因表达能够抑制细胞的增殖。活化的肝星状细胞的凋亡是一个非常复杂的过程，涉及多种因素及细胞因子的相互作用，肝星状细胞活力维持，与这些因子的作用有密切关系，本研究应用RNAi技术将TIMP-1siRNA转染肝星状细胞12、24、48h后，发现随着培养细胞的时间增加TIMP-1mRNA表达逐渐降低，同时用流式细胞仪检测早期凋亡的结果显示细胞凋亡数量不明显，分析的原因可能为参与到肝星状细胞的激活、转化及调节的细胞因子可多达几十种，因此，体外培养的肝星状细胞中单独降低了TIMP-I的表达可能不一定会直接引起其凋亡。

　　作者简介：徐华锋(1971―)，男，黑龙江哈尔滨人，博士研究生，讲师，主要从事生物大分子结构和功能关系的研究；于晓光(1963―)，女，黑龙江哈尔滨人，哈尔滨医科大学教授，博士生导师，通讯作者，主要从事生物大分子结构和功能关系的研究。