D变异型血型 [Ｄ型产气荚膜梭菌青海分离株ε毒素遗传变异分析]
2020-01-01 00:00:00私享空间
摘要：研究Ｄ型产气荚膜梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）青海分离株ε毒素基因的遗传变异特点，试验设计特异性引物扩增ε毒素基因，目的基因片段大小为８８８ ｂｐ。建立ＰＣＲ反应体系并设置反应条件，扩增产物进行电泳检测、纯化、测定核苷酸序列，与
摘要：研究Ｄ型产气荚膜梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）青海分离株ε毒素基因的遗传变异特点，试验设计特异性引物扩增ε毒素基因，目的基因片段大小为８８８ ｂｐ。建立ＰＣＲ反应体系并设置反应条件，扩增产物进行电泳检测、纯化、测定核苷酸序列，与参考序列进行同源比对分析。结果表明，目的基因扩增良好，分离菌株ＷＣ－ｅｐｓｉｌｏｎ－ＦＬ与菌株Ｃ６０－３、ＮＣＴＣ ８３４６、Ｍｕｋｔｅｓｈｗａｒ、ＡＪ２５０９５６的核苷酸序列的同源性依次为９９．９％、９９．８％、９８．９％、９９．４％。
关键词：Ｄ型产气荚膜梭菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）；ε毒素；遗传变异 中图分类号：Ｓ８５２ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）15－3183-03 Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ ε Ｔｏｘｉｎ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ Ｔｙｐｅ Ｄ Iｓｏｌａｔｅｄ from Ｑｉｎｇｈａｉ ＹＥ Ｇｕｉ－ｓｈｅｎｇ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ， Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ａｎｉｍａｌ Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ， Ｑｉｎｇｈａｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｘｉｎｉｎｇ ８１００１６，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ ε ｔｏｘｉｎ ｇｅｎｅ ｏｆ ……此处隐藏2280个字…… ＣＣＴＴ－３′。 １．２ 方法 １．２．１ 增菌培养 按培养基说明书配制，无菌操作进行产气荚膜梭菌的厌氧培养。 １．２．２ ＤＮＡ提取 参照细菌基因组提取试剂盒说明书进行。 １．２．３ 毒素基因的ＰＣＲ扩增 反应体系：Ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ、ｄＮＴＰ ４ μＬ、上游引物 １ μＬ、下游引物 １ μＬ、模板 １ μＬ，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶 ０．５ μＬ、补灭菌水至５０ μＬ。反应条件：９４ ℃ １ ｍｉｎ、４７ ℃ １ ｍｉｎ、７２ ℃ １ ｍｉｎ，３５个循环，然后７２ ℃ １０ ｍｉｎ，４ ℃ 保存。 １．２．４ 扩增结果检测 扩增结束后取５ μＬ扩增产物进行１％琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。 １．２．５ 序列分析 将扩增产物纯化后测序并进行同源性分析。 ２ 结果与分析 ２．１ ε毒素基因ＰＣＲ扩增检测 ε毒素基因所在泳道２出现目的条带，目的基因条带清晰，表明扩增效果良好（图１）。 ２．２ ε毒素基因核苷酸序列分析 应用ＤＮＡｓｔａｒ软件对所测菌株ε毒素基因核苷酸进行分析，结果表明（表1）所测青海分离株ε毒素基因Ａ＋Ｔ含量较高，其碱基组成含有较多的腺嘌呤和胸腺嘧啶。 ２．３ ε毒素基因核苷酸序列同源性分析